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«MODULATION OF POLYAMINE METABOLISM AS A CHEMOPREVENTIVE STRATEGY OF PHYTOCHEMICALS IN A CELL CULTURE MODEL OF COLORECTAL CANCERS Dissertation zur ...»

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MODULATION OF POLYAMINE METABOLISM AS A CHEMOPREVENTIVE STRATEGY

OF PHYTOCHEMICALS IN A CELL CULTURE MODEL OF COLORECTAL CANCERS

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

Dr. oec. troph.

im Fachbereich Agrarwissenschaften, Ökotrophologie und Umweltmanagement

der Justus Liebig Universität Giessen

SANDRA ULRICH

Aus dem Zentrum der Inneren Medizin der Johann Wolfgang Goethe Universität Medizinische Klinik I Direktor: Prof. Dr. S. Zeuzem Schwerpunkt Gastroenterologie und Ernährungsmedizin Leiter: Prof. Dr. Dr. J. Stein Frankfurt am Main

MODULATION OF POLYAMINE METABOLISM AS A CHEMOPREVENTIVE

STRATEGY OF PHYTOCHEMICALS IN A CELL CULTURE MODEL OF

COLORECTAL CANCERS

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. oec. troph.

im Fachbereich Agrarwissenschaften, Ökotrophologie und Umweltmanagement der Justus Liebig Universität Giessen

Gutachter:

Prof. Dr. Katja Becker Justus Liebig Universität, Giessen Prof. Dr. Dr. Jürgen Stein Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt am Main Vorgelegt von DIPL. OEC. TROPH. SANDRA ULRICH Frankfurt am Main 2007 I Disputationstermin 28.01.2008 Dekan Prof. Dr. R. Herrmann Vorsitzende des Promotionsausschusses Haushalts- und Ernährungswissenschaften Prof. Dr. A. Otte Prüfungsvorsitzende Prof. Dr. I. Hoffmann

1. Gutachterin Prof. Dr. K. Becker-Brandenburg

2. Gutachter Prof. Dr. Dr. J. Stein (3. Gutachter Prof. Dr. U. Wenzel) Prüfer Prof. Dr. M. Krawinkel Prüfer PD Dr. O. Schröder II "Let thy food be thy medicine and thy medicine be thy food."

Hippocrates (460-377 B.C.) III SUMMARY Introduction: Resveratrol a natural occuring polyphenol present in red wine, peanuts and grapes, has been reported to exhibit a wide range of biological and pharmacological properties. In addition to cardioprotective and antiinflammatory effects, potent chemopreventive activities of resveratrol and its analogs in various carcinogenesis models are described and there has been a great deal of experimental effort directed toward defining these effects. We and others could previously demonstrate that resveratrol inhibits cell growth in several malignant cell lines via modulation of polyamine metabolism. In detail, resveratrol was shown to simultaneously inhibit biosynthetic ornithine decarboxylase (ODC) and activate catabolic spermine/spermidine acetyltransferase (SSAT). One aim of this work was to specify the underlying molecular mechanisms of resveratrol actions in colorectal cancer cells and especially to identify possible roles of transcription factor peroxisomeproliferator activated receptor γ (PPARγ) and the sphingolipid metabolite ceramide.

Previous studies could demonstrate that ursolic acid (UA), a pentacyclic triterpene found in berries and plants, has antiproliferative as well as proapoptotic activities on cancer cells. The objective of this second project was to elucidate the underlying molecular mechanisms of these chemopreventive effects.

Methods: The colorectal cancer cell lines Caco-2, HCT-116 and HT29 were cultured under standard conditions and were treated with miscellaneous agents for different time intervals. Cytotoxicity was excluded by commercial kit measuring lactate dehydrogenase activity in the supernatant of damaged cells.

Cell growth was determined by BrdU incorporation and crystal-violet staining.

Protein levels were examined by Western blot analysis. The activity of the enzyme SSAT was assayed with a radiometric technique measuring the amount of synthesized [acetyl-14C]-spermidine. ODC activity was also assayed radiometrically measuring [14CO2]-liberation. Ceramide concentrations were detected by HPLC-coupled mass-spectrometry. A dominant-negative PPARγ mutant was transfected in Caco-2 cells to suppress PPARγ-mediated functions.

IV PPARγ ligand dependent transcriptional activity was measured via a luciferase assay. Apoptosis induction was detected by measuring DNA fragmentation.

Caspase-3 induction was determined via an activity assay.

Results: Resveratrol [30-200 µmol/L] inhibits cell growth both in Caco-2- and HCT-116 cells in a dose- and time-dependent manner. In contrast to Caco-2wildtype- resveratrol failed to increase SSAT activity in dominant-negativePPARγ-cells. PPARγ involvement was further confirmed via ligand dependent activation as well as the induction of specific PPARγ-dependent target Cytokeratin 20 after resveratrol-treatment. Resveratrol further increases the expression of PPARγ coactivator PGC-1α as well as SIRT1 in a dosedependent manner after 24h of incubation. Co-incubation with SB203580 abolishes SSAT activation significantly in both cell lines. The involvement of MAPK p38 was further confirmed by a resveratrol-mediated phosphorylation of p38 protein in both cell lines. Resveratrol further increases the expression of PPARγ coactivator PGC-1α as well as SIRT1 in a dose-dependent manner.

Moreover, the antiproliferative effects of resveratrol closely correlate with a dose-dependent increase of endogenous ceramides. Compared to controls the cell-permeable ceramide analogs C2- and C6-ceramide significantly inhibit ODC-activity in Caco-2 and HT29 cells. C6-ceramide further diminished protein levels of protooncogenes c-myc and ODC, which is strictly related to the ability of ceramides to inhibit cell growth in a time- and dose-dependent manner.





These results were further confirmed using inhibitors of sphingolipid metabolism, where only co-incubation with a serine palmitoyltransferase inhibitor could significantly counteract resveratrol-mediated actions. These data suggest that the induction of ceramide de novo biosynthesis but not hydrolysis of sphingomyelin is involved in resveratrol-mediated inhibition of ODC. The relevance of intracellular polyamine depletion was further confirmed by exogenous polyamines which could counteract the growth inhibitory effects mediated by resveratrol. In contrast to the regulation of catabolic SSAT by resveratrol, inhibitory effects on ODC occur PPARγ-independently, indicating independent pathways of resveratrol-action.

We could also show, that treatment with UA leads to a significant time- and dose-dependent cell growth inhibition of Caco-2, HCT-116 as well as HT29 cells, coincident with the upregulation of the cell cycle regulators cyclin E, V p21WAF1/Cip1 and p27Kip1. In addition, UA significantly induces apoptosis, which is mediated by an increase of BAX/Bcl-2-protein-ratio as well as an upregulation of TRAIL protein which meets in an induction of caspase-3 activity.

Furthermore, we could show that UA leads to a PPARγ-dependent induction of SSAT but in contrast to resveratrol does not inhibit biosynthetic ODC activity.

Conclusions: On the basis of these findings, p38 MAPK as well as transcription factor PPARγ can be considered as molecular targets of resveratrol in the regulation of cell proliferation and SSAT activity respectively in a cell culture model of colon cancer. Moreover, the results provide evidence for the involvement of ceramide de novo biosynthesis in resveratrol mediated inhibition of ODC activity.

The observed reduction of cell growth of colon cancer cell lines after treatment with ursolic acid presumably results from a large increase in the number of apoptotic cells. The induction of the catabolic enzyme SSAT via PPARγdependent mechanisms therby seems to present the major molecular target in the induction of programmed cell death.

Due to these results the phytochemicals resveratrol as well as ursolic acid could show great chemopreventive and therapeutic potential in the treatment of colorectal cancers.

VIZUSAMMENFASSUNG

Einleitung: Resveratrol (3, 4‘, 5-Trihydroxy-trans-stilben) ist ein natürlich vorkommendes Polyphenol, welches vorwiegend in Trauben, Erdnüssen und Rotwein zu finden ist. Neben kardioprotektiven und antiinflammatorischen Wirkungen werden Resveratrol auch verschiedene chemopräventive Eigenschaften zugesprochen. In früheren Untersuchungen konnten wir bereits zeigen, dass Resveratrol die Hemmung des Zellwachstums in kolorektalen Karzinomzellen, zumindest teilweise, über die Modulation des Polyaminstoffwechsels vermittelt, zum einen über die Hemmung der bisynthetischen Ornithin Decarboxylase (ODC) und zum anderen über die Aktivierung der katabolen Spermidin/Spermin-Acetyltransferase (SSAT). Ein Ziel unserer weiterführenden Untersuchungen war es nun, die molekularen Mechanismen dieser Resveratrol-vermittelten Effekte genauer zu charakterisieren. Von besonderem Interesse waren dabei die mögliche Beteiligung des nukleären Transkriptionsfaktors Peroxisom-Proliferator aktivierter Rezeptor γ (PPARγ), sowie der Ceramide, eine zu den Lipiden zählende Untergruppe der Sphingolipide.

Die Ursolsäure (UA) ist ein pentacyclisches Triterpen, das überwiegend in Beeren, Früchten, Kräutern und der natürlichen Wachsschicht von Äpfeln und Birnen zu finden ist. Neben antiinflammatorischen und hepatoprotektiven Wirkungen weisen epidemiologische Untersuchungen auch auf chemopräventive Effekte der UA hin. Ein weiteres Ziel war es daher, auch die molekularen Mechanismen dieser Effekte näher zu charakterisieren Methodik: Die kolorektalen Karzinomzelllinien Caco-2, HCT-116 und HT29 wurden unter Standardbedingungen kultiviert. Die Zellen wurden über definierte Zeiträume mit steigenden Konzentrationen verschiedener Substanzen inkubiert.

Zytotoxische Wirkungen der eingesetzten Konzentrationen wurden in Vorversuchen mittels eines Zytotoxizitätstestes (Messung der Laktat Dehydrogenase-Freisetzung) ausgeschlossen. Die Zellzahl wurde anhand des BrdU Einbaus in die DNS, die Zellzahl mittels Kristallviolettfärbung ermittelt.

Verschiedene Proteine wurden durch Western Blot Analyse dargestellt und densitometrisch ausgewertet. Die Aktivität der SSAT wurde mittels [Acetyl-14C]VII Spermidin-Bindungsassay quantifiziert. Zur Aktivitätsbestimmung der ODC wird radioaktiv markiertes Substrat zum Zelllysat gegeben und die Freisetzung von [14CO2] gemessen. Zur Hemmung der PPARγ-vermittelten Funktionen wurde eine dominant-negative Mutante in Caco-2-Zellen transfiziert. Die Ceramidbiosynthese nach Resveratrol-Inkubation wurde mit HPLCMassenspektrometrie erfasst. Die Ermittlung der Liganden-bindungsabhängigen PPARγ-Promotoraktivität erfolgte mittels Luziferase-Assay. Die Erfassung der Caspase-3-Aktivität sowie der DNA-Fragmentierung mittels ELISA dienten als Marker der Apoptose-Induktion.

Ergebnisse: Resveratrol [50-200µM] führte sowohl in Caco-2- als auch in HCTZellen zu einer zeit- und dosis-abhängigen Hemmung der Zellproliferation sowie einer Reduktion der Zellzahl. Resveratrol führte signifikant zu einem Anstieg der SSAT-Aktivität nach 24h sowohl in Caco-2-Wildtyp, als auch in Caco-2-Nullvektor-Zellen, während keine Effekte detektiert werden konnten, wenn die PPARγ-vermittelten Effekte unterdrückt sind. Eine Beteiligung von PPARγ konnte zudem durch die Liganden-abhängige Promotoraktivierung, sowie durch die Induktion des spezifischen PPARγ-Targets Cytokeratin 20 bestätigt werden. Zudem führte Resveratrol dosisabhängig zur Expressionssteigerung des PPARγ Coaktivators PGC1α sowie SIRT1 nach 24h Inkubation. Co-Inkubation mit dem spezifischen MAPK p38 Inhibitor SB203580 wirkte signifikant der Resveratrol-induzierten SSAT-Aktivierung entgegen. Eine Aktivierung von p38 konnte weiterhin durch einen Anstieg von phosphoryliertem p38 auf Proteinebene nachgewiesen werden.

Koinzident mit der zeit- und dosisabhängigen Zellwachstumshemmung führt Resveratrol signifikant zu einem Anstieg der intrazellulären Ceramidkonzentration in kolorektalen Karzinomzellen. Im Vergleich zur Kontrolle hemmt das membrangängige Ceramid-Analogon Hexanoylsphingosin (C6) signifikant die Expression der Protooncogene c-myc und ODC, sowie zusätzlich die ODC-Enzymaktivität in Caco-2 und HT29-Zellen, was signifikant mit einer dosisabhängigen Hemmung des Zellwachstums durch Ceramide korrelierte. Darüber hinaus führte die Co-Inkubation mit Ceramidsyntheseinhibitoren zu einer signifikant Verminderung der Resveratrolinduzierten Effekte, was auf eine Induktion der Ceramid-Neusynthese durch Resveratrol, nicht aber auf eine Hydrolyse von Sphingomyelin schließen lässt.

VIII Im Gegensatz zur Aktivierung der SSAT erfolgte die Hemmung der ODC durch Resveratrol PPARγ-unahbängig.

Weiterhin konnten wir zeigen, dass UA [10-30µM] zu einer signifikanten zeitund dosisabhängigen Hemmung der Zellproliferation, sowie einer Reduktion der Zellzahl von Caco-2-, HCT-116- und HT29-Zellen führt, was mit einer deutlichen Expressionssteigerung der Zellzyklusregulatoren Cyclin E, p21WAF1/Cip1 und p27Kip1 korreliert. UA führte zudem koinzident zu einer dosisabhängigen Expressionssteigerung von TRAIL, sowie einem gesteigerten BAX/Bcl-2Protein-Quotienten, was wiederum in einer gesteigerten Caspase-3-Aktivität und darauf folgender DNA-Fragmentierung resultiert. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die Inkubation mit UA zu einer PPARγ-abhängigen SSATAktivierung führt, im Gegensatz zu Resveratrol aber nicht gleichzeitig auch die Aktivität der ODC hemmt.

Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass sowohl die Aktivierung der p38 MAPK, als auch des Transkriptionsfaktors PPARγ essentielle Ereignisse für die Resveratrol-vermittelte Induktion der katabolen SSAT darstellen. Des weiteren scheint die Aktivierung der de novo Ceramidbiosynthese entscheidend an der Resveratrol-induzierten ODCHemmung beteiligt zu sein.

Weitere Daten lassen darauf schließen, dass die wachstumshemmenden Effekte der Ursolsäure überwiegend durch Zunahme apoptotischer Zellen vermittelt werden. Die Apoptose wird dabei sowohl über extrinsische, als auch intrinsische Signaltransduktionswege induziert, wobei die PPARγ-abhängige Aktivierung der SSAT eine zentrale Rolle einzunehmen scheint.

Diese in vitro Daten weisen auf potente chemopräventive und –therapeutische Eigenschaften der natürlichen Pflanzeninhaltsstoffe Resveratrol und Ursolsäure hin und könnten daher vielversprechende Kandidaten in der Entwicklung neuer Therapiekonzepte in der Behandlung des kolorektalen Karzinoms darstellen.

IX Diese Dissertation basiert auf den folgenden Veröffentlichungen und Manuskripten, auf die im Text mit römischen Ziffern verwiesen wird.



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